COURS TERMINALE ST2S - CHIMIE-BIOCHIMIE PHYSIOLOGIE HUMAINE
THEME : SPECTROSCOPIE ET DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
Introduction : Les techniques spectroscopiques sont fondamentales dans les laboratoires d'analyses medicales. Elles permettent d'identifier et de doser des molecules d'interet biologique (glucose, proteines, enzymes, medicaments) a partir de prélèvements biologiques (sang, urine). Ces dosages sont essentiels pour le diagnostic, le suivi de pathologies et le depistage.
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1. Principe General de la Spectroscopie : Interaction Lumiere-Matiere
La spectroscopie etudie l'interaction entre un rayonnement electromagnetique (la lumiere) et la matière (une molecule).
- Principe : Lorsqu'une molecule recoit de l'energie lumineuse, elle peut absorber une partie de cette energie. Cette absorption est selective : elle depend de la structure de la molecule.
- Mecanisme : L'energie absorbee permet a la molecule de passer d'un etat d'energie fondamental a un etat d'energie excite.
- Spectroscopie IR : L'energie (infrarouge) excite les vibrations des liaisons chimiques.
- Spectroscopie UV-Visible : L'energie (UV ou visible) excite les electrons des liaisons (notamment les doubles liaisons et cycles aromatiques).
- Spectre d'absorption : C'est la "carte d'identite" d'une molecule. C'est un graphique qui represente la quantite de lumiere absorbee en fonction de la longueur d'onde (ou du nombre d'onde). Chaque molecule a un spectre caracteristique.
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2. Spectroscopie Infrarouge (IR) : Identifier les Groupes Fonctionnels
Principe : On envoie un rayonnement infrarouge sur un echantillon. Les liaisons chimiques qui ont un moment dipolaire variable (comme O-H, C=O, N-H) absorbent a des frequences precises et se mettent a vibrer (etirement, deformation).
Applications : Identification qualitative des groupes fonctionnels presents dans une molecule inconnue. Pas de dosage quantitatif courant en biologie medicale.
Domaines d'absorption caracteristiques (a connaitre) :
- Liaison O-H (alcools, acides carboxyliques) : Large bande vers 3200 - 3600 cm⁻¹.
- Liaison N-H (amines, amides) : Bande(s) fine(s) vers 3300 cm⁻¹.
- Liaison C=O (cetones, aldehydes, acides, esters) : Bande intense et fine vers 1700 cm⁻¹ (variations selon le groupe).
- Liaison C-H : Bandes vers 2900-3000 cm⁻¹.
Exemple en diagnostic : Identification de metabolites anormaux dans certaines maladies metaboliques hereditaires rares.
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3. Spectroscopie UV-Visible et Dosages Biologiques
Principe : Une molecule (appelee chromophore) absorbe dans l'UV (200-400 nm) ou le Visible (400-800 nm), provoquant une transition electronique. La solution prend alors une couleur complementaire a celle qu'elle absorbe.
Loi de Beer-Lambert : Fondamentale pour le dosage quantitatif.
'A = ε . l . c'
- A = Absorbance (sans unite). Mesuree par le spectrophotometre.
- ε = Coefficient d'extinction molaire (L.mol⁻¹.cm⁻¹). Caracteristique de la molecule a une longueur d'onde donnee.
- l = Longueur du trajet optique (cm). Epaisseur de la cuve (souvent 1 cm).
- c = Concentration de l'espece absorbante (mol/L).
Si ε et l sont constants, A est proportionnelle a c. C'est le principe du dosage.
Techniques de dosage :
- Colorimetrie / Spectrophotometrie : On mesure l'absorbance d'une solution coloree a une longueur d'onde fixe.
- Protocole type :
- Preparation d'une gamme etalon de solutions de concentrations connues.
- Mesure de leur absorbance.
- Trace de la droite d'etalonnage A = f(c).
- Mesure de l'absorbance de l'echantillon inconnu.
- Determination de sa concentration par lecture graphique sur la droite.
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4. Spectrometrie de Masse (SM) : Identifier et Peser les Molecules
Principe : Cette technique ne repose pas sur l'absorption de lumiere. Elle permet de determiner la masse moleculaire d'un compose et d'obtenir des informations sur sa structure.
Etapes principales :
- Ionisation : Vaporisation et transformation des molecules neutres en ions positifs (souvent par impact electronique).
- Acceleration et Tri : Les ions sont acceleres par un champ electrique puis tries selon leur rapport masse/charge (m/z) dans un analyseur (ex : quadripole).
- Detection : Un detecteur compte les ions arrivant pour chaque rapport m/z.
Resultat : Le spectre de masse.
- En abscisse : le rapport m/z.
- En ordonnee : l'intensite relative des ions.
- Pic moleculaire M⁺• : Pic correspondant a l'ion molecule (m/z = masse moleculaire). C'est souvent le pic de plus grand m/z (sauf pour les pics isotopiques).
- Pics de fragmentation : L'ion molecule peut se casser en fragments plus petits, donnant des informations sur la structure.
Applications medicales : Dosage tres precis de medicaments (therapie medicamenteuse), de steroides (dopage), de toxiques, proteomique (étude des proteines).
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5. Applications Medicales des Dosages Spectrophotometriques
Ces dosages sont souvent couples a des reactions enzymatiques specifiques qui generent un produit colore.
- Dosage des Proteines Seriques (Ex : Methode de Bradford) :
- Principe : Le reactif de Bradford (bleu de Coomassie) se fixe sur les proteines et change de couleur (brun -> bleu).
- Utilisation : Bilan hepatique (dosage de l'albumine), bilan renal, suivi nutritionnel.
- Valeurs usuelles : Albumine serique : 35 - 50 g/L.
- Dosage du Glucose (Ex : Methode GOD-POD) :
- Reaction enzymatique en cascade :
- Glucose Oxydase (GOD) : Glucose + O₂ + H₂O → Acide gluconique + H₂O₂
- Peroxydase (POD) : H₂O₂ + Chromogene incolore → Chromogene colore + H₂O
- L'intensite de la couleur est proportionnelle a la concentration en glucose initial.
- Utilisation : Diagnostic et suivi du diabete (glycemie a jeun > 1.26 g/L).
- Valeurs usuelles : Glycemie a jeun : 0.70 - 1.10 g/L.
- Analyses Toxicologiques : Dosage de l'alcool (ethanol) dans le sang, de medicaments, de drogues.
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6. Chromatographie : Separer avant d'Analyser
La chromatographie est une technique de separation des constituants d'un melange. Elle est souvent couplee a la spectroscopie (ex : chromatographie + spectrometrie de masse).
- Principe general : Le melange a separer est entraine par une phase mobile (liquide ou gaz) a travers une phase stationnaire (solide ou liquide fixe). Les molecules se separent selon leur affinite differente pour ces deux phases.
- Chromatographie sur Couche Mince (CCM) :
- Phase stationnaire : Silice deposee sur une plaque.
- Phase mobile : Solvant (eluant) qui monte par capillarite.
- Resultat : Des taches a differentes hauteurs. On calcule le Rf (Rapport frontal) = Distance parcourue par la tache / Distance parcourue par le solvant.
- Application : Controle de purete, depistage rapide de toxiques.
- Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) :
- Phase mobile liquide poussee a haute pression a travers une colonne.
- Tres efficace, quantitative, automatisable.
- Application medicale majeure : Chromatographie d'affinite pour l'Hemoglobine glyquee (HbA1c), marqueur essentiel du controle glycemique sur 3 mois chez les diabetiques.
Conclusion : La spectroscopie et les techniques associees (chromatographie) sont des outils indispensables du diagnostic biologique. Elles permettent une identification precise et un dosage fiable des biomolecules, fournissant au clinicien des donnees objectives pour etablir un diagnostic, prescrire un traitement et en evaluer l'efficacite.
